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TOPO Cloning Kit

——2017-11-09

TOPO Cloning Kit

 

GT1505-20T  GV TOPO-TA-Amp Cloning Kit實用于Taq DNA聚合酶擴增的末尾加“A”的PCR片斷的疾速克隆

GT1503-20T  GV TOPO-Blunt-Amp Cloning Kit實用于PfuKOD等高保真聚合酶擴增的平末尾的PCR片斷的疾速克隆

産品規格:20T

保留與運輸:-20℃。

 

1、産品特色

1、銜接只需5 min

2、載體不含LacZ基因,無需藍白斑挑選。

3、優良PCR産物(不過特異性條帶、無引物二聚體)可直接停止克隆,無需純化。

 

2、PCR産物的制備:

1、擴增引物不克不及磷酸化。

2PCR反響停止後,電泳檢測PCR産物産量和質量,如有非特異性擴增或引物二聚體,則需切膠收受接管目標條帶落後行克隆。

 

3、操作步調

克隆反響:

1、室溫下,按下表配制反響系統:

試劑

添加量

DNA片斷

0.5-8 μl

TOPO cloning vector

1 μl

10×TOPO Buffer

1 μl

ddH2O

x μl

   銜接反響系統的整體積爲10μl(用ddH2O補足)。輕彈離心管將反響系統混勻,長久離心3-5s

   注:全部操作進程均在室溫前提下停止,切勿在冰上操作。

   假如PCR産物電泳檢測唯壹很亮的目標條帶,不過特異性條帶和引物二聚體,可取0.5-1μlPCR産物原液直接停止克隆

2、將離心管于室溫(22-30℃)下靜置0-5 min(弗成跨越5 min)。反響停止後將離心管放置在冰上,停止後續的轉化操作。

         注:室溫下(22-30℃)反響時光弗成跨越5 min,時光太長克隆效力會降低。若室溫較 低,建議應用PCR儀控溫,可設置25℃反響5min。若銜接産物未能立刻用于轉化,需保留于-20℃。不建議對銜接産物做歷久保留。

3、陽性對比試驗:

1μl試劑盒供給的對比片斷停止克隆、轉化後,將菌液塗布在含有響應抗生素的造就平板上,37℃造就留宿。取菌斑停止PCR擴增。

附:分歧長度的DNA片斷的最適添加量參照表:

DNA片斷巨細(bp

最適添加量(ng

100-1000

20-50

1000-2000

50-100

2000-5000

100-200

轉化(此操作需在無菌前提下停止):

 

1、取5 μl銜接産物參加到50-100 μl 方才熔化的感觸感染態細胞中(感觸感染態細胞應剛從-80℃掏出,于冰上熔化,方才熔化便參加銜接産物),平和混勻,冰浴2-30 min

242℃水浴熱激30s。(勿晃悠離心管)

3、立刻轉移到冰上,靜置2 min(冰浴時代勿晃悠離心管)。

4、參加300-500 μl LB造就基(不含抗生素),37℃,200-250 rpm振蕩造就60 min

注:當拔出片斷的長度<2 kb時,可省略蘇醒步調(步調4),直接將轉化後的菌液塗布在含氨苄青黴素的平板上,37℃造就留宿。

5、取200 ul菌液,塗布于含氨苄青黴素的平板上37℃造就留宿。

注:若想取得更多克隆,可將菌液低速(3000 g)離心2 min,棄失落部門上清液,用移液器奏樂至菌體完整重懸,汲取全體菌液塗布于含氨苄青黴素的平板上,37℃造就留宿。

 

檢測:

1、菌落PCR法(無菌操作):

1)遴選單菌落至10 μl無菌水中,充足混勻。

2)取2 μl菌液作爲PCR反響的模板,用試劑盒供給的M13F/M13R引物擴增拔出片斷。

3PCR反響前提

     94  2 min

     94  30 sec

     56  30 sec    30 cycles

     72  1 kb/min  (依據片斷巨細肯定延長時光)

     72  10 min

4)電泳檢測PCR産物,若載體自連,則擴增出的片斷巨細爲143 bp

5)肯定重組子後將殘剩的8 μl菌液轉接到LB造就基中(含響應的抗生素),搖菌造就留宿,然後提取質粒停止測序。

2、限制性酶切法:

1)挑取單克隆至LB造就基中(含響應抗生素),留宿搖菌,抽提質粒。

2)用EcoRI/EcoRV/PstI或適合的限制性內切酶,對證粒停止酶切,判定重組子。

 

測序:

    用M13FM13R通用引物測序,然落後行序列剖析。

       M13F5-TGTAAAACGACGGCCAGT-3

       M13R5-CAGGAAACAGCTATGACC-3

 

4、罕見成績剖析:

重組子克隆菌少,或陽性率低:

1、感觸感染態效力低:應用轉化效力>5×107fcu/μg的感觸感染態細胞;

2、銜接反響在高溫下(如碎冰上)操作:應在室溫下操作;

3、銜接反響時光太長:室溫下放置5min便可,時光太長效力會降低;

4PCR産物參加量太少或太多:依照推舉量參加;

5PCR産物純度低:從新擴增或從新純化PCR産物;

6PCR産物資量低,切膠十紫外照耀時光長:應用藍光切膠儀切膠或加速切膠速度,削減PCR産物在紫外下裸露的時光;

7、轉化後沒有做蘇醒:可參加LB造就基(無抗生素)震動造就60min

8、克隆基因能夠對宿主菌有毒性,好比某些編碼膜卵白和DNA聯合卵白的基因,某些啓動子和調理序列基因,或含有顛倒或串連反復序列的基因:選用室溫留宿造就平板。

 

附:載體圖譜


 


 

 


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